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三、DHA生产理论研究

1、DHA的代谢途径

1.1 DHA的分解代谢

天然不饱和脂肪酸多为顺式，需转变为反式构型,才能被β-氧化酶系作用，进一步氧化分解。在生物体内，不饱和脂肪酸的氧化需要更多酶的参与才能顺利进行，由于双键的存在，使DHA比饱和及单不饱和脂肪酸更难氧化分解。DHA不能在线粒体中β-氧化，而是被过氧化物酶体氧化，皮肤表皮15-脂氧合酶的活性非常高，将DHA转化为17-羟基二十碳六烯酸。DHA被哺乳动物吸收后，绝大部分结合成甘油三酯。

1.2 DHA的合成代谢

哺乳动物自身不能合成DHA，但可由摄食的油酸、亚油酸或亚麻酸转化而成。在动物体内，摄食的油酸或亚油酸主要转化为AA，而合成的DHA极少且缓，人体内DHA主要由植物油亚麻酸转化而来，由于转化涉及3种酶（其中△6去饱和酶为限速酶）的代谢过程，因此转化效率较低。

微生物合成多价不饱和脂肪酸通常是在单不饱和脂肪酸基础上开始，合成机制与高等生物一致，包括延长碳链和去饱和作用两个过程，分别由相应的膜结合延长酶和脱饱和酶催化，使碳链增长；脂肪酸脱饱和体系由微粒体膜结合的细胞色素 b5、NADH-细胞色素b5还原酶和脱饱和酶组成。微生物合成 DHA是从油酸开始，其脱饱和途径是ω-3；供体（乙酰CoA或丙二酰单酰CoA）提供两 个碳原子，在 12、13位C原子之间引入一个双键，形成亚油酸，再在15、16位碳原子间引入一个双键， 形成α-亚麻酸，再经进一步的碳链延长和脱饱和而形成DHA.

2、影响微藻培养生产DHA 的理化因素

2.1 物理因素

影响微藻生长生产DHA的物理因素有光照、温度、溶氧量、盐度、pH值等。

（1）光照：脂肪酸的合成具有藻种的特异性。

（2）温度：不同的温度对藻细胞的生长具有较大的影响。随温度的升高，藻细胞的代谢和呼吸作用加快，生长速率增大。而随温度的减低，藻细胞的代谢和呼吸作用降低。细胞内的多不饱和脂肪酸累积量逐渐增大，DHA含量也逐渐增大。

（3）盐度：盐度对微藻脂肪酸组成的影响因种而异。一般来说，在高盐浓度下，多不饱和脂肪酸的含量下降。而在适宜的盐度时，DHA含量随着盐度的升高而增大。

（4）溶氧量：在脂肪酸的代谢途径中，分子氧参与脂肪酸的去饱和过程是多不饱和脂肪酸合成过程的限制因子，微藻发酵生产DHA的含量也受氧浓度的影响。一般来说，高浓度的溶氧中生产的DHA含量大于低浓度中的DHA含量。

（5）pH值：不同的微藻都有其适宜的pH值。它不仅影响了微藻细胞内外的离子平衡，也影响了藻细胞膜的通透性。

此外，培养周期、培养密度、保存方式也对微藻生产DHA有影响。

2.2 化学因素

（1）碳氮比：培养基中的氮源组成主要影响微藻细胞内饱和及不饱和脂肪酸的比例，当培养基中C/ N比升高时，Chlorellasorokiniana细胞内多不饱和脂肪酸的含量增大。同时培养基的碳、氮源的选择也影响了微藻生产DHA的产量，这表现为不同的藻种对碳、氮源有不同的适应性。

（2）氯化钠：在海洋藻类中，钠离子的作用主要是调节细胞生长中胞内外的渗透压。在高盐浓度下，藻细胞的细胞膜的流动性和渗透压降低，多不饱和脂肪酸含量下降，DHA的含量也下降，而低盐度下时DHA的含量较高。

2.3 微藻生产DHA的方式

（1）自养方式

对光合自养的微藻进行研究，发现一些光合自养微藻能产生 DHA。如光甲藻和隐甲藻中，DHA是磷脂酰胆碱的主要成分，特别是隐甲藻体内，将近总脂肪酸的50%的成分为 DHA。人们也已经从海藻中发现DHA，含量占总脂肪酸的12%~36%。光合自养微藻的大规模培养多采用开放式池、封闭式池和封闭式光合生物反应器系统进行培养。

（2）异养方式

与自养培养方式相比，其具有培养过程无需光照，减少能量；可具有较大的培养密度，可提高底物的转化率，缩短了发酵周期;能控制温度、溶氧等培养参数。

目前，已经成功地进行了隐甲藻异养及混养的研究。

2.4 影响真菌合成DHA的因素

2.4.1 培养基的组成

（1）碳源：真菌发酵生产 DHA时，不同的碳源对生物量、菌体脂质量和脂质 DHA含量都有极大的影响。总体而言，葡萄糖是较佳的碳源，生物量、菌体脂质量、脂质DHA含量以及DHA产量都是较高的。葡萄糖也是油脂发酵生产中最常使用的碳源，而且可被有效转化为油脂。

（2）氮源：氮的数量和来源对真菌合成多不饱和脂肪酸有着重要的影响。酵母抽提物、 谷氨酸钠和胰蛋白胨有利于Thraustochytriumaureum ATCC 34304的生长，其中以酵母抽提物的生物量最高，谷氨酸钠还有利于脂质的积累，各种氮源对脂质DHA的含量影响不是十分明显，从DHA的产量看，酵母抽提物和谷氨酸钠为较好的氮源。

（3）碳氮比：除了碳源、氮源外，培养基中碳氮比也影响真菌合成DHA。 微生物生长于碳源过剩、氮源不足，或者是剥夺氮源的环境，便会激发和促进脂质的积累作为碳及能源的备用库。一般情况下高的碳氮比有利于脂质的积累和促进菌体的生长，但碳氮比过高，脂质中DHA含量将会下降。

（4）无机盐及微量元素：在培养海洋微生物时，除非培养基中含有足够的所有必需微量元素，否则，较好采用天然海水。由于破囊壶菌和裂殖壶菌均为海生真菌，因此培养基中添加一定量无机盐是非常必要的。

（5）前体促进剂：一些有机酸和维生素对真菌合成 DHA也是十分有用的 。

2.4.2 通气与搅拌

微生物合成多不饱和脂肪酸过程中的去饱和作用需要分子氧的参与，分子氧的有效性决定其产生脂肪酸的不饱和度。因此，提高培养基中氧浓度有利于不饱和脂肪酸的合成。机械搅拌对培养Thraustochytrium 和 Schizochytrium 生产DHA有不同的影响。由于Thraustochytrium缺乏细胞壁和富含不饱和脂肪酸，细胞脆性大，机械搅拌抑制其生长。 但Schizochytrium的情况则不同，适当提高搅拌速度能促进菌体的生长。另外，搅拌器的叶轮类型对菌体的生长也有影响。

2.4.3 初始pH值

真菌生产DHA时,选择适宜的初始 pH值也是十分重要的。

2.4.4 温度对DHA的生产有着极其重要的影响

嗜冷微生物比嗜温微生物能合成更多的多不饱和脂肪酸。许多研究也表明， 低温能促进微生物合成不饱和脂肪酸。Brown和Rose认为，由于低温增加氧的可溶性，产生大量胞内分子氧，有利于需氧参与的长链脂肪酸的去饱和作用。另外，低温下，微生物产生大量多不饱和脂肪酸也是一种适应低温环境的手段，因为多不饱和脂肪酸，特别是EPA、DHA能保持微生物细胞膜低温流动性，从而维持细胞正常功能。

2.4.5 种龄和接种量

种龄显著影响Thraustochytriumaureum ATCC34304的脂质积累和 DHA产量，对生物量和脂质DHA含量影响不大，种龄24h和5%的接种量时脂质积累和 DHA产量最高。

2.4.6 光照

破囊弧菌和裂殖弧菌为具有光刺激生长特性的海生真菌，因此，光照对其生产DHA也有影响，Thraustochytriumaureum ATCC34304在33W 荧光灯光照下的生物量、脂质量和DHA产量都比黑暗培养时高。

2.4.7 培养时间

破囊弧菌和裂殖弧菌发酵初期的生物量和脂质量呈线形增加，至对数生长末期达到最高，此后，生物量保持平稳，而脂质量有所下降。DHA含量随培养时间变化并不明显。

目前，研究多不饱和脂肪酸的合成途径、去饱和酶基因的性质、藻细胞内脂肪酸的组成、分布、DHA合成的途径及合成前体物质等也为多不饱和脂肪酸的工业化生产提供了更多的理论基础。

四、DHA的分离提取

1、低温分级法

利用不同的脂肪酸在过冷的有机溶剂中的溶解度差异来分离浓缩 DHA。即将总脂肪酸置于1~10倍的无水丙酮中 ,并冷却至-25℃以下，混合液的下层为饱和的脂肪酸和低度的不饱和脂肪酸结晶，而上层含有大量的高度的不饱和脂肪酸的丙酮溶液，将混合液过滤，滤液在真空下蒸馏除去丙酮，就可得到较纯的DHA。

2、溶剂提取法

利用不同脂肪酸的金属盐在某种有机溶剂中的差异来分离浓缩DHA。该种方法是通过皂化后，在皂液加入H2SO4，并将pH调至1~2 ，分离上层粗脂肪酸乙醇混合液，加入回收乙醇，并反复水洗粗脂肪酸至pH为中性。即可得相对较纯的DHA。

3、尿素包合法

脂肪酸与尿素的结合能力取决于其不饱和程度，脂肪酸的不饱和程度越高，其于尿素结合的能力越弱。因而可将饱和脂肪酸、低度不饱和脂肪酸、高度不饱和脂肪酸分离开来。然后，利用适当的溶剂萃取，真空干燥后可得到DHA含量较高的不饱和脂肪酸。

4、超临界 CO2萃取法

超临界流体萃取(supercritical fluid extraction，简称 SFE)是近代发展起来的一种新型化工分离技术。它原理主要是将DHA溶于超临界状态的CO2中，通过改变温度和压力，达到分离DHA的目的。它能够分离出较纯的DHA，但是对含有相同的碳数而双键不同的脂肪酸却效果较差。此外，现在还具有脂肪酶水解法、膜分离法、硝酸银层析法、高效液相色谱法等。

5、酶法破碎

细胞破碎的方法而言可分为机械法和非机械法，机械法包括珠磨法、高压匀浆法、超声波法和微波法等；非机械法包括溶酶法、酸热法和自溶法等。

酶解法是一种研究较广的细胞破碎方法，它利用酶反应，分解破坏细胞壁上的特殊键，从而达到破壁的目的。

自溶法是一种特殊的溶酶方式，其所需的溶胞酶是由微生物本身产生的。事实上，在微生物生长代谢过程中，大多都能产生一定的水解自身细胞壁上聚合物结构的酶，以便使生长繁殖过程进行下去。控制一定条件，可以诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。目前常用的自溶促进剂有食盐、乙醇、甲苯、硫醇等。某些试验是通过在菌液加入NaCl使其达到一定的浓度进行处理的。不溶固形物的含量随处理时间延长而减少，这是因为NaCl溶液中，存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，引起细胞膜发生破裂，使得细胞水解酶与底物接触而被激活，分解细胞，原生质外溢，胞内产物释放致使不溶固形物减少。

自溶作用是酶解的另一种方法，在一定程度上能用于工业生产，但对不稳定的微生物则容易引起蛋白质变性，自溶后细胞培养液过滤速度也会降低。

其使用方法为：溶菌酶是专门作用于微生物细胞壁的水解酶，酶解条件为：pH值7·2的0·2 mol·L-1的磷酸钾缓冲溶液， 0·8 mol·L-1的氯化钾溶液，0·5%的溶菌酶。在30℃将菌体振荡不同时间后离心，菌体酶解后加入丙酮。影响因素：温度、PH、自溶时间等对自溶效果都有影响，根据菌体的不同而有不同的影响。

酶法破碎的缺点：酶法避免了大量有机溶剂的使用，但酶作用的条件比较苛刻，这给过程的操作带来麻烦。

目前很多是将酶法与四川其它各种细胞破碎方法结合起来，如酶解-超声波法，酶解-高压破碎法等。

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